Exosomas en queratocono
Exosomas En Queratocono: Posibles Usos Diagnósticos Y Terapéuticos
El queratocono es una enfermedad corneal que se caracteriza por un estrechamiento del estroma y un alargamiento hacia afuera de éste, tomando forma de cono. Es una enfermedad crónica que conlleva una pérdida progresiva de la visión, derivando finalmente en la necesidad de realizar un trasplante de córnea. No existe un tratamiento eficaz que detenga la progresión de la enfermedad, ni un marcador molecular diagnóstico precoz que permita frenar su desarrollo en estadios más tempranos.
Los exosomas son pequeñas vesículas, de entre 30 y 100 nm, que son secretadas al medio extracelular por gran cantidad de tipos celulares, tanto sanos como enfermos. La formación de estas vesículas comienza en los cuerpos multivesiculares, para posteriormente ser liberados al exterior en forma de exosomas. Los exosomas son esenciales en la comunicación celular y la diferenciación de diversos tipos celulares, transportando una gran cantidad de proteínas diferentes, ARN mensajero y microARN que modulan diversas funciones en las células diana.
Esquema que representa la formación de los exosomas en la célula de origen. Asimismo se puede observar su contenido específico.
En nuestro laboratorio se ha procedido al aislamiento y purificación de líneas celulares de estroma sano y líneas celulares de estroma de queratocono. Una vez purificados, la cantidad de proteína presente en el interior de estas vesículas fue cuantificada para su posterior análisis mediante espectrometría de masas.
El estudio preliminar del contenido proteico en los exosomas ha arrojado resultados prometedores, mostrando una importante diferencia en su contenido dependiendo de si su origen son células sanas o enfermas. Estos resultados podrían señalar alguna molécula o conjunto de moléculas que podrían servir como marcador diagnóstico del queratocono.
La investigación continuará con la purificación, secuenciación y análisis del contenido en ARN de los exosomas. Esto podría arrojar luz sobre el mecanismo por el cual la enfermedad progresa, debido al importante papel de dichos ARNs en la regulación de la expresión génica en la célula diana.
En cuanto al posible interés terapéutico de los exosomas obtenidos a partir de las células estromales sanas podemos decir que, tras la realización de ciertos experimentos en los que aplicábamos exosomas aislados de las células sanas a células de queratocono, se observó una regresión al estado sano de ciertos genes de proteoglicanos. Estos genes están fuertemente implicados en la estructuración de las láminas de colágeno que forman la córnea, lo cual podría abrir la puerta al tratamiento del queratocono mediante medicación y evitar la cirugía corneal.
Esquema de las partes de un ojo sano y de uno con queratocono.
Esquema de las partes de un ojo sano y de uno con queratocono.
La córnea del ojo es una estructura transparente cuya función principal es permitir el paso de luz al interior del ojo y proteger el iris y el cristalino. Para que la córnea realice su función correctamente, esta debe mantener dicha transparencia y su curvatura debe ser la adecuada. Existen diversas patologías de la córnea, entre las que se encuentra el queratocono.
El queratocono es una enfermedad corneal que se caracteriza por un estrechamiento del estroma de la córnea y un alargamiento hacia afuera de éste, tomando forma de cono. Provoca una pérdida progresiva de la visión, llegando a ser tan severa que el paciente necesita de un trasplante de córnea. Actualmente no existe un marcador molecular diagnóstico de la enfermedad ni un tratamiento eficaz que detenga el avance del queratocono.
Los exosomas son pequeñas vesículas, de entre 30 y 100 nm, que son secretadas al medio extracelular por gran cantidad de tipos celulares, entre los que se encuentran linfocitos y células tumorales. Se originan en los cuerpos multivesiculares para posteriormente ser liberados al exterior en forma de exosomas. Las principales funciones de los exosomas son: la comunicación célula-célula y el transporte a las células diana de gran cantidad de proteínas diferentes, ARN mensajero y microARN.
Estudiando el contenido proteico de los exosomas aislados de células estromales sanas y sus homologas enfermas de queratocono, se han podido observar moléculas diferentes entre ambos tejidos.
No solo podría haber diferencias a nivel proteico entre los exosomas producidos por las células estromales. Cabe pensar que su contenido en material genético (ARN mensajero y microARN) también podría ser diferente. Mediante un procedimiento de secuenciación masiva, podríamos detectar y secuenciar dicho ARN y compararlo. Es posible que entre esos microARN haya alguno que esté implicado en el cambio morfológico que provoca esta enfermedad.
Debido a que no existe un tratamiento del queratocono mediante ningún medicamento, la posibilidad de que los exosomas producidos por células sanas sean capaces de “reeducar” a las células estromales enfermas era muy esperanzador. Para saber si esto era cierto, se diseñó un experimento que consistía, principalmente, en la adición a las células estromales sanas y enfermas de exosomas. A las células sanas se les añadió exosomas aislados del medio de cultivo de las células enfermas de queratocono y viceversa.
Esquema del experimento de intercambio de exosomas entre la línea estromal sana y la de queratocono.
Tras exponer al tejido a los exosomas, se extrajo el ARN de las células, con el que mediante una PCR reversa se obtuvo el cDNA correspondiente. Finalmente, mediante una PCR cuantitativa se analizaron los niveles de expresión de los PGs, dado que entre las múltiples funciones que realizan se encuentra la estructuración de la matriz extracelular. Cabe destacar el papel central que los PG y los GAGs llevan a cabo en la ordenación de la matriz extracelular del estroma corneal, siendo esenciales en la ordenación de las fibrillas de colágeno, y por tanto, para su transpariencia y una correcta visión.
Resumen del análisis transcriptómico realizado en las células estromales sanas y de queratocono tras e intercambio de exosomas.
Théry, C., Zitvogel, L., & Amigorena, S. (2002). Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology, 2(8), 569. http://doi.org/10.1038/NRI855
Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., & Mittelbrunn, M. (2014). Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology, 28(1), 3–13. http://doi.org/10.1016/j.semcancer.2014.04.009
Hessvik, N.P. & Llorente (2018),Current knowledge on exosome biogénesis and reléase, A. Cell. Mol. Life Sci. 75: 193. https://doi.org/10.1007/s00018-017-2595-9
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