Estudios en glaucoma
Nuevas Aproximaciones Moleculares Al Diagnóstico De Glaucoma
El incremento en la esperanza de vida y la disminucion de la tasa de natalidad tienen un efecto directo en la proporción de personas mayores de 65 años, grupo poblacional que esta aumentando rapidamente en Espana. Durante el envejecimiento aumenta el riesgo de padecer ciertas enfermedades, entre las que se encuentran las enfermedades neurodegenerativas. El ojo, considerado como una extension de nuestro cerebro, no esta exento a padecer patologias neurodegenerativas asociadas al envejecimiento, como son el glaucoma y la degeneracion de la macula asociada a la edad (DMAE). En lineas generales, esta Unidad de Investigacion centra su actividad investigadora en las patologias oculares asociadas a la edad, el glaucoma y la DMAE, principales causas de ceguera irreversible en Espana y en el mundo, con objeto de potenciar un envejecimiento saludable de la poblacion espanola.
En primer lugar, continuamos con el ambicioso proyecto de “Diagnostico Precoz de Glaucoma”, con objeto de llevar a cabo un diagnostico de las patologias glaucomatosas mas prevalentes antes de que el dano sea irreversible y haciendo posible realizar un tratamiento preventivo de la patologia. Ademas, este estudio puede conducir al descubrimiento de nuevas dianas terapeuticas y en ultima instancia al desarrollo de agentes neuroprotectores. En segundo lugar, hemos potenciado e impulsado la linea de investigacion en DMAE, estudiando el sistema antioxidante zinc-metalotioneinas como nueva diana terapeutica. Por ultimo, hemos continuado con los estudios geneticos asociados a enfermedades oculares. Todo ello es posible gracias al enfoque multidisciplinar de nuestro grupo de investigacion, a la colaboracion del personal clinico del Instituto Oftalmologico Fernandez-Vega (IOFV) y al network establecido con grupos de investigacion nacionales e internacionales.
A continuacion se describen los resultados mas relevantes de nuestra investigacion durante el ano 2016, las publicaciones en revistas cientificas de prestigio internacional, las participaciones en congresos mas relevantes y los proyectos de investigacion obtenidos en convocatorias publicas y competitivas.
I.I. Desarrollo de una metodología para el Diagnóstico Precoz de Glaucoma.
Nuestro grupo de investigacion ha trabajado en la busqueda de biomarcadores genicos y proteicos para el diagnostico de las patologias glaucomatosas mas frecuentes, el GPAA y el GPEX. La linea convencional para el desarrollo de biomarcadores implica una fase de descubrimiento seguida de una fase de validacion en muestras de grandes
cohortes poblacionales previa a su aplicacion clinica. Mientras que en la fase de descubrimiento se pretende identificar proteinas candidatas a biomarcadores de la enfermad, la fase de validacion tiene como objetivo evaluar las caracteristicas de dichas proteinas desde el punto de vista de la clasificacion patologica y realizar un proceso de
acreditacion de las mismas mediante el empleo de tecnologias analiticas robustas, reproducibles y cuantitativas sobre un elevado numero de muestras con relevancia clinica. Aquellas proteinas acreditadas con exito son aptas para su utilizacion en el desarrollo de un test de diagnostico de aplicacion clinica.
I. Biomarcadores para el diagnóstico precoz de Glaucoma.
El glaucoma es una de las principales causas de ceguera en paises industrializados y se estima que el numero de personas afectadas en todo el mundo en el ano 2020 alcanzara los 80 millones. El glaucoma engloba un grupo de neuropatias opticas de origen multigenico y multifactorial, caracterizadas por una degeneracion progresiva del
nervio optico, la muerte de las celulas ganglionares de la retina y la perdida de campo visual. El comienzo de esta patologia es mayoritariamente asintomatico y el diagnostico se realiza en estados ya avanzados de la enfermedad, una vez que la perdida de la vision es considerable e irreversible. De ahi la gran importancia que tiene el estudio
de los signos y sintomas precoces de la enfermedad, a fin de poder abordarla en sus estadios iniciales y evitar su progresion empleando los tratamientos existentes.
El glaucoma primario de angulo abierto (GPAA) y el glaucoma pseudoexfoliativo (GPEX) se encuentran entre los tipos de glaucoma mas frecuentes en paises desarrollados incluyendo Espana. Su incidencia se incrementa con la
edad, a partir de los 40 anos, con una prevalencia del 2% en mayores de 60 anos. El factor de riesgo mas conocido, asociado con el GPAA, es la elevacion de la presion intraocular (PIO) relacionada con una disfuncion en el drenaje del humor acuoso debido a una obstruccion de la malla trabecular. El GPEX es un glaucoma secundario, relacionado con el crecimiento de agregados fibrilares de material procedente de tejidos del segmento anterior del ojo (es decir, iris, cristalino y cuerpo ciliar) que se produce en personas con sindrome pseudoexfoliativo. En ciertas regiones del mundo, como el noroeste de Espana, la prevalencia de GPEX entre pacientes con dicho sindrome
puede alcanzar el 30%. Dadas las dificultades existentes para realizar un diagnostico precoz del glaucoma, con las tecnicas psicofisicas y morfologicas disponibles actualmente, resulta imperativo disenar nuevas estrategias de diagnostico para identificar entre la poblacion individuos en estadios tempranos de la enfermedad, asi como para el seguimiento de individuos con riesgo de desarrollarla. Para ello, el abordaje que actualmente se trata de llevar a cabo, desde un punto de vista clinico, esta basado en la busqueda de biomarcadores de la enfermedad. La identificacion de biomarcadores no solo resulta util para el diagnostico del glaucoma ya que, si se logra su deteccion en las etapas mas tempranas, se podria iniciar el tratamiento antes y establecer las pautas de seguimiento mas adecuadas para evitar las graves
consecuencias de esta patologia. Por lo tanto, dado el interes para la salud publica, resulta prioritario, y un reto a nivel mundial, el desarrollo de un test de diagnostico de glaucoma no invasivo, de facil acceso a los profesionales de la salud y aplicable a grandes cohortes poblacionales.
Esta linea de investigacion se esta abordando a traves de dos proyectos coordinados, consistentes en el desarrollo de una metodologia que permita validar e implementar los biomarcadores identificados en nuestro grupo para realizar un diagnostico precoz de la enfermedad, y en el estudio de un modelo animal que desarrolla glaucoma para establecer nuevas dianas terapeuticas, tal y como se describe a continuación.
Se ha logrado la identificacion de un panel de 35 proteinas alteradas (sobre- o sub-expresadas) en las muestras de suero de pacientes con glaucoma. Estudios funcionales, con el programa IPA (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com), mostraron que 22 de 35 de las proteinas identificadas pertenecen a una misma red de senalizacion dentro de un network generico conocido como: presentacion de antigenos, respuesta inmune humoral y respuesta inflamatoria. Este estudio nos sugiere que en pacientes con glaucoma existe una alteracion en las proteinas que participan en sistemas de senalizacion asociados a la activacion del complemento y a procesos inflamatorios.
Las alteraciones en las proteinas identificadas fueron confirmadas en un numero limitado de muestras (un total de 88 pacientes) con ensayos ELISA comerciales (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), analizandose las 17 proteinas mejor clasificadas y mas discriminantes del total de las 35 identidades proteicas. Los resultados obtenidos indican que 13 de las 17 proteinas cuantificadas por ELISA, manifiestan diferencias estadisticamente significativas en sus niveles sericos entre sujetos con glaucoma (GPAA y GPEX) y sujetos controles. Dichas proteinas, por orden, de mayor a menor significancia son: APOA4, C3, TF, VTN, TTR, SERPINA1, FBLN1, APOA1, FCN3, CFH, ITIH4, APOL1 y ALB. La aplicacion de modelos de aprendizaje basados en curvas ROC (Receiver Operating Characteristic) para cada uno de dichos biomarcadores individuales mostraron valores de AUC (Area Under the Curve, area bajo la curva) superiores en todos los casos a 0.5 (significativo) y por encima de 0.8 (muy significativo) para muchos de ellos, demostrando la utilidad de cada una de estas proteinas como candidatas a biomarcadores. Estos datos han sido protegidos por medio de Patente Europea (Method for the diagnosis of glaucoma based on the determination of serum protein levels, no EP13382059.7).
Debido a la dificultad actual de cuantificar de manera simultanea varias proteinas (i.e., biomarcadores) en muestras de suero y con vistas a desarrollar una tecnologia de diagnostico de rutina para su uso en medicina clinica, se esta estudiando la cualificacion de los biomarcadores de glaucoma descritos mediante la aplicacion de nuevas tecnologias, para asi establecer un panel definitivo que sirva de base para el desarrollo de un test de diagnostico precoz. Resulta imprescindible realizar una validacion de los biomarcadores mediante el empleo de tecnologías analiticas robustas, reproducibles y cuantitativas sobre un elevado numero de muestras. En los ultimos anos, la Espectrometria de Masas en tandem en el modo de adquisicion MRM (“multiple reaction monitoring”) se ha consolidado como una tecnica de referencia debido a su gran sensibilidad, selectividad, y capacidad de deteccion. Gracias a nuestra colaboracion con el Grupo de Investigacion de Isotopos Estables Enriquecidos de la Universidad de Oviedo se esta desarrollando una metodologia de cuantificacion de proteinas basadas en peptidos diana que permiten analisis cuantitativos muy reproducibles y a gran escala.
En la Figura 1 se muestra el esquema del procedimiento actual que se esta llevando acabo en nuestra Unidad.
Para ello, se ha seleccionado en primer lugar un panel de 3 proteinas formado por Apolipoproteina A4 (APOA4), Complemento C3 (C3) y Vitronectina (VTN), que es el que mejor clasifica los tres grupos de sujetos estudiados, tal y como se indica en la Tabla 1. Como se observa en esta Tabla 1, se han empleado varios algoritmos de aprendizaje, mediante los que se han obtenido datos de Sensibilidad, Especificidad y Area Bajo la Curva (Area Under the Curve, AUC). El AUC es un parametro que proporciona una percepcion acerca de la calidad y capacidad de discriminación de cada biomarcador candidato, pudiendo clasificarse desde Excelente hasta No valido. Empleando este panel, se ha procedido en una segunda etapa a la optimizacion y aplicacion de un metodo de cuantificacion absoluta de proteinas mediante analisis por dilucion isotopica y espectrometria de masas en tandem en modo MRM para la cuantificacion de los biomarcadores seleccionados. Esta metodologia basada en proteomica cuantitativa, denominada genericamente MRM, se encuentra patentada por el Grupo de Isotopos Estables Enriquecidos de la Universidad de Oviedo (no Patente ES2472724 y fecha de prioridad 21/3/2014).
Tabla 1. Capacidad clasificatoria entre los grupos GPEX, GPAA y Controles obtenida mediante el panel de marcadores APOA4 C3 y VTN, implementando diferentes algoritmos clasificatorios. AUC>0.9 es indicativo de una clasificacion de los grupos patológicos como Excelente, empleando el panel de biomarcadores candidatos
Figura 1. Etapa de validacion de biomarcadores candidatos
Figura 1. Etapa de validacion de biomarcadores candidatos
Con este objetivo, se esta empleando la metodologia “bottom-up proteomics” para la identificacion y cuantificación de la proteina de interes a partir de sus peptidos caracteristicos. Esta metodologia consiste en realizar una hidrolisis enzimatica de la muestra (i.e., tripsina) para obtener los peptidos tripticos especificos de cada biomarcador. Para llevar a cabo la cuantificacion, al digerido se le anade una cantidad conocida de un peptido analogo al de interes pero enriquecido isotopicamente. Esta mezcla se analiza mediante cromatografia de liquidos acoplada a un espectrometro de masas en tandem (HPLC-ESI-MSMS), empleandose un triple cuadrupolo en el modo
MRM. Con este analisis se alcanza una alta selectividad y sensibilidad en la Determinacion permitiendo llevar a cabo determinaciones de proteinas en niveles de partes por billon (ppb). A continuacion se describen las etapas especificas llevadas a cabo:
・ Seleccion de peptidos proteotipicos de las proteinas candidatas a biomarcadores. Se han seleccionado los 6 peptidos proteotipicos de las proteinas candidatas a biomarcadores, i.e, Apolipoproteina AIV, Complemento C3 y Vitronectina.
・ Caracterizacion de los peptidos de abundancia natural y enriquecidos isotopicamente. Se ha procedido a la caracterizacion de los 6 peptidos proteotipicos seleccionados, de abundancias naturales y enriquecidos isotópicamente en 13C. Se analizaron las abundancias isotopicas de los peptidos naturales y marcados mediante la
comparativa entre los valores experimentales y teoricos. Posteriormente se llevo a cabo su purificacion mediante cromatografia semi-preparativa. Finalmente se ha realizado la optimizacion del metodo de adquisicion MOPs, junto con la separacion cromatografica de los peptidos, asi como la fuente ESI y la celda de colision, para cada una
de las proteinas de interes.
・ Estudio de la hidrolisis enzimatica con el tiempo. Se ha llevado a cabo la hidrolisis enzimatica de cada una de las proteinas de interes, de manera independiente, anadiendo los peptidos enriquecidos sintetizados con objeto de monitorizar la reaccion con el tiempo, y asi obtener el tiempo optimo de hidrolisis para asegurar la digestión completa de la proteina. Se recogieron alicuotas de cada reaccion desde 0 minutos hasta 30 horas y a cada una se le anadio el correspondiente peptido enriquecido. Cada mezcla se analizo mediante HPLCESI-MSMS en modo MRM y se midieron las senales correspondientes a la relacion peptido natural y enriquecido. La hidrolisis fue completa, es decir, el peptido se libero de la proteina despues de 10, 8 y 10 horas para las proteinas C3, APOA4 y VTN, respectivamente.
・ Estudios de recuperacion en presencia y en ausencia de matriz. Se han llevado a cabo los estudios de recuperación en presencia y ausencia de matriz. Para ello, hemos procedido a la fortificacion de muestras de agua con las proteinas de interes a tres niveles de concentracion 5, 15 y 50 μg/g. Se emplea agua para evaluar la presencia de
interferencias procedentes de los reactivos. Se han obtenido recuperaciones cuantitativas en todos los casos, lo que indica ausencia de interferencias de matriz. La metodologia analitica optimizada se esta aplicando al analisis de muestras de suero de pacientes del biobanco establecido en el IOFV-FIO, en colaboracion con el personal clinico. Teniendo en cuenta la importancia de los resultados obtenidos, y la capacidad multiplexada (simultanea) de determinacion de los biomarcadores de interes,
se considera este un metodo de diagnostico muy prometedor. Sin embargo, y como principal limitacion, el tiempo requerido para la determinacion cuantitativa y simultanea de APOA4, C3 y VTN en muestras de suero es hasta la fecha relativamente alto. Se requieren aproximadamente 2 dias para obtener un valor cuantitativo preciso, fiable
y reproducible. Por tanto, es imprescindible llevar a cabo una optimizacion del procedimiento de analisis de las muestras para tratar de disminuir el tiempo empleado por analisis, hasta unas pocas horas. En lineas generales, puede concluirse que la metodologia desarrollada posee elevado potencial como herramienta para llevar a cabo
la validacion de los biomarcadores. Actualmente se esta realizando el analisis cuantitativo de estas proteinas en el suero de pacientes con glaucoma y controles de una amplia cohorte poblacional. Al mismo tiempo, se ha planificado la puesta a punto de las restantes proteinas que forman parte del panel de candidatos a biomarcadores de
glaucoma.
La aplicacion de esta metodologia nos permitira darle utilidad sanitaria a esta investigacion, estableciendo una proyeccion traslacional que llevaria al diagnostico clinico del glaucoma, y, de producirse este precozmente, a una mejora en la calidad de vida de los pacientes con esta patologia.
I.II. Identificación de posibles dianas y estrategias terapéuticas que puedan ser de utilidad en la prevención y/o detención de la progresión de la enfermedad mediante el estudio de un modelo animal.
La validacion de biomarcadores permitira identificar posibles dianas terapeuticas de prevencion/bloqueo de la progresion de la enfermedad. Para conseguir este objetivo se esta utilizando la cepa de raton DBA/2J como modelo animal experimental de glaucoma. Esta cepa manifiesta muchas de las caracteristicas patologicas del glaucoma
humano, incluyendo elevacion de la PIO, dano progresivo en el nervio optico y perdida de celulas ganglionares de la retina. Aproximadamente el 70% de los ratones DBA/2J desarrollan glaucoma de manera espontanea. La enfermedad se inicia con el incremento progresivo de la PIO, sobre los 8 meses de edad, debido a anormalidades en el iris relacionadas con mutaciones recesivas en dos genes, Gpnmb (proteina nmb glicosilada) y Tyrp1 (proteína 1 relacionada con la tiroxinasa).
Este modelo animal permite realizar un seguimiento de las alteraciones de las proteinas candidatas a biomarcadores a lo largo de los diferentes estadios de la enfermedad (ver Figura 2), y lo que es mas importante, estudiar las alteraciones en los niveles de estas proteinas en la transicion entre las fases pre-glaucomatosa y glaucomatosa y comparar estos niveles con los de los ratones de la misma cepa que no llegan a desarrollar la enfermedad, asi como con los de otra cepa control (cepa D2-Gpnmb+). Asi se podra identificar que marcador(es), dentro de la ruta de senalizacion de la que forma parte, comienza a alterarse en la transicion entre la fase pre-glaucomatosa y la fase inicial de la enfermedad.
Figura 1. Etapa de validacion de biomarcadores candidatos
Figura 2. Desarrollo experimental con el raton DBA/2J. C1, ratones D2-Gpnmb+; C2, ratones DBA/2J pre-glaucomatosos; C3, ratones DBA/2J que no desarrollan glaucoma; G1, ratones del grupo C2 con glaucoma inicial a los 10,5 y 14 meses y G2, ratones del grupo C2 con glaucoma avanzado a los 14 meses.
Con este fin, se han tomado muestras de sangre de cada raton a los 4.5, 10.5 y 14 meses de vida y se ha extraido el suero que sera sometido a ensayos ELISA para la cuantificacion de las proteinas candidatas a biomarcadores. 2. Muestras de suero de los ratones Gpnmb+ y DBA/2J
Paralelamente a las extracciones de sangre, y con el objeto de seguir la evolucion de la patologia, en el caso de los ratones afectados, o de comprobar la falta de esta en los individuos control, se han realizado medidas de la presión intraocular y electroretinogramas de todos los ratones en busca de signos glaucomatosos. Se ha llevado a cabo la obtencion de electroretinogramas, empleando el equipo RETI-port/scan21, a los 4.5, 10.5 y 14 meses de edad, revelando que esta tecnica no es efectiva para el diagnostico del glaucoma en estos ratones. En la Figura 3
se muestra la evolucion de la presion intraocular en nuestros ratones DBA/2J y Gpnmb+. Ademas de las medidas a los 4, 10 y 14 meses de edad, se tomaron medidas a algunos ratones a los 2, 6 y 8 meses para saber el momento de elevacion de la PIO con mas precision.
Como se observa en la Figura 3, en los ratones DBA la PIO comienza a elevarse despues de los 6 meses de edad hasta los 10 meses. A los 14 meses vuelve a tener valores normales. En estos valores estan incluidos todos los ratones DBA, tanto los que tuvieron elevacion de la PIO como los que no, por eso las desviaciones estandar son tan
altas. Solo el 70% de los ratones DBA sufren elevacion de la presion intraocular y por consiguiente glaucoma. Si eliminamos los DBA que no desarrollaron glaucoma, aumentarian las diferencias.
Figura 2. Desarrollo experimental con el raton DBA/2J. C1, ratones D2-Gpnmb+; C2, ratones DBA/2J pre-glaucomatosos; C3, ratones DBA/2J que no desarrollan glaucoma; G1, ratones del grupo C2 con glaucoma inicial a los 10,5 y 14 meses y G2, ratones del grupo C2 con glaucoma avanzado a los 14 meses.
Figura 3. Evolucion de la PIO en los ratones con glaucoma (DBA/2J) y controles (Gpnmb+).
Posteriormente, se ha sacrificado a los animales, a los 14 meses de edad, con objeto de evaluar los danos producidos a nivel del nervio optico, y dilucidar si los ratones DBA/2J han desarrollado o no glaucoma, y su estadio. Para ello se ha realizado el contaje de los axones de los nervios opticos, pudiendose asi determinar a que grupo asignar las distintas muestras de suero.
Una vez sacrificado el raton, se procede a la enucleacion de los ojos y a la diseccion y fijacion de los nervios opticos, que posteriormente son embebidos en resina para la realizacion de los cortes histologicos. Los cortes del nervio optico se realizan trasversalmente y en la zona equivalente a la lamina cribosa humana, region en la que primero comienza a apreciarse la muerte de los axones en glaucoma.
Una vez obtenidos los cortes se tinen con el colorante parafenilendiamina (PPD), el cual presenta alta afinidad por las vainas de mielina y el axoplasma de los axones danados, lo cual nos permite distinguir los axones sanos de los danados. Posteriormente utilizamos un Microscopio Leica DM6000 para visualizar las secciones y hacemos fotografías seriadas que incluyen todo el area del nervio optico, con el programa LAS X. De cada foto seleccionamos un rectangulo central, de 1000 μm2 y contabilizamos los axones incluidos en ese area. El area de los rectangulos fue establecida de manera que nos aseguramos de estar contando los axones de mas del 10% del area total del nervio
optico. El contaje se realiza manualmente utilizando el programa FIJI (ImageJ-win64).
A modo de ejemplo, en la Figura 4 se muestran 3 imagenes correspondientes cada una al nervio optico de un ojo de un raton DBA tras su sacrificio a los 14 meses. Como se puede ver, la primera foto corresponde al nervio óptico del raton DBA10, que no ha desarrollado glaucoma. Las otras dos fotos corresponden a los nervios opticos del
raton DBA13, que a los 14 meses presentaba un glaucoma muy severo en el ojo derecho y glaucoma en una fase intermedia en el ojo izquierdo.
Figura 4. Imagenes de secciones de nervio optico de ratones DBA/2J tras su sacrificio a los 14 meses.
Se han fijado y embebido en resina los nervios opticos de todos los ratones incluidos en el estudio (25 ratones Gpnmb+ y 57 ratones DBA/2J). Hasta la fecha se contaron los axones de los nervios opticos de 17 ratones Gpnmb+ y 37 ratones DBA/2J (Figura 5). Para la cepa Gpnmb+ (33 ojos), el area media del N.O. fue 120416}21236 μm2 con un numero medio de axones de 51110}8580. Las muestras de suero de esta cepa constituyen el grupo C1.
Para la clasificacion de las muestras de suero de los ratones DBA/2J segun la presencia/estadio de la patología hemos considerado como glaucoma avanzado la presencia de menos de 20000 axones en el nervio optico de al menos un ojo, intermedio entre 20000 y 40000 axones en al menos un ojo y sin glaucoma con mas de 40000 axones en ambos ojos.
En base al numero de axones presente en los N.O. de cada raton, las muestras de suero se clasifican en 5 grupos experimentales. Tres grupos control (C1, C2 y C3), uno integrado por las muestras de suero de ratones de la cepa D2-Gpnmb+ (C1) que raramente desarrolla glaucoma, otro por muestras de ratones de la cepa DBA/2J en estadios pre-glaucomatosos (C2), es decir, ratones de 4.5 meses, y un tercero formado por muestras de individuos de la cepa DBA/2J que no desarrollen glaucoma a lo largo de su vida (C3). Los otros 2 grupos se corresponderan con muestras de ratones de la cepa DBA/2J de 10.5 y 14 meses de edad, con distinto grado de glaucoma, bien inicial
(G1) o avanzado (G2).
Entre los ratones DBA/2J, ocho no desarrollaron glaucoma (muestras del grupo C3), con un area media del N.O. de 117578}18768 μm2 y no medio de axones de 52509}7686.
El resto de los ratones DBA/2J analizados hasta el momento (29) desarrollaron glaucoma, por lo que las muestras de suero de estos ratones recogidas a los 4,5 meses constituyen el grupo C2, muestras de suero de individuos preglaucomatosos.
Cuatro ratones DBA/2J presentaron glaucoma intermedio en al menos un ojo, con un area media del N.O. de 111299}128966 μm2 y un no medio de axones de 28975}7226 (6 ojos). Las muestras de suero de estos ratones recogidas a los 10,5 meses constituyen el grupo G1, muestras de suero de individuos con glaucoma inicial.
Por ultimo, 25 ratones DBA/2J presentaron glaucoma avanzado en al menos un ojo, con un area media del N.O. de 75482}18192 μm2 y un no medio de axones de 5860}4514 (31 ojos). Las muestras de suero de estos ratones recogidas a los 14 meses constituyen el grupo G2, muestras de suero de individuos con glaucoma avanzado.
Figura 5. Numero de axones en el N.O. de los ratones Gpnmb+ y DBA/2J a los 14 meses (n=no de ojos).
Para completar el estudio se requiere la cuantificacion de las proteinas candidatas a biomarcadores de glaucoma en las muestras de suero obtenidas a lo largo de los 14 meses de vida del modelo animal. Con ello se podran seleccionar las variables mas discriminantes entre grupos e identificar los “pathways” en los que estan involucradas. En la actualidad, se estan optimizando los analisis basados en ELISA para dicha cuantificacion. Con este tipo de estudios perseguimos el objetivo de avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares de la enfermedad y sacar a la luz posibles dianas terapeuticas que abran las puertas al diseno de nuevas estrategias para la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad.