Glicobiología en la Microbiología
Los Proteoglicanos Como Receptores Celulares
Los proteoglicanos como receptores celulares de Acanthamoeba en la córnea.
La queratitis es una inflamación de la córnea con diferentes grados de afección, pudiendo ocurrir en los casos más severos la producción de úlceras. Es una dolencia de origen multifactorial, siendo los más frecuentes la presencia de pequeños traumatismos o las infecciones por diferentes microorganismos como bacterias, virus o amebas.
Representación esquemática de una úlcera corneal.
La queratitis amebiana está causada por amebas del género Acanthamoeba que se encuentran de manera ubicua tanto en suelos como en aguas dulces o saladas. Su ciclo biológico consta de dos estadios: una forma activa, llamada trofozoíto, con capacidad infecciosa y reproductora, y una forma latente o de quiste, capaz de resistir a condiciones ambientales adversas.
Imagen al microscopio de Acanthamoeba en forma de trofozoíto (izquierda) y en forma de quiste (derecha).
La infección ocular producida por estos protozoos está estrechamente relacionada con el uso de lentes de contacto y su incorrecta desinfección. Además se ha descrito, que la presencia de microtraumatismos corneales facilita su entrada a través del epitelio corneal pudiendo llegar en el peor de los casos al estroma.
Son muchos los casos de infecciones en los que los glicosaminoglicanos de la superficie celular eucariota actúan como receptores mediando la adherencia e invasión del patógeno. Ante la posibilidad de que ocurriese algo semejante en las queratitis amebianas, llevamos a cabo diversos estudios para ver la implicación de los glicosaminoglicanos como mediadores en la adhesión amebiana a células corneales. En los resultados se obsevó que Acanthamoeba se une a estas moléculas de la superficie corneal, siendo el HS la especie de glicosaminoglicano más implicada en este proceso.
Tal y como se ha citado anteriormente, la presencia de pequeños traumatismos o heridas corneales favorece las infecciones por ameba. Por ello, se está analizando en profundidad el mecanismo molecular por el que Acanthamoeba se une con distinta afinidad a las células de las distintas capas corneales en presencia o ausencia de heridas. Esto puede permitir en un futuro la posibilidad de bloquear al menos, en cierta manera, la unión de este protozoo a la córnea frenando su invasión y por tanto el proceso inflamatorio.
Siddiqui, R., & Khan, N. A. (2012). Biology and pathogenesis of Acanthamoeba. Parasites & vectors, 5(1), 6.
Garg, P., Kalra, P., & Joseph, J. (2017). Non-contact lens related Acanthamoeba keratitis. Indian Journal of Ophthalmology, 65(11), 1079.
Bases moleculares del uso de los proteoglicanos de superficie epitelial corneal como receptores de adherencia en infecciones bacterianas
En torno a 500.000 pacientes sufren infecciones oculares en todo el mundo, las cuales pueden conducir a una disminución de la agudeza visual, cicatrización irreversible, e incluso ceguera. El epitelio corneal constituye la interfase con el medio ambiente y representa una barrera activa contra patógenos, bacterias comensales, estímulos tóxicos y alérgenos. Debido a la constante alteración física que supone el pestañeo y el flujo de lágrimas, así como a la presencia de numerosos componentes antibacterianos, la superficie ocular de individuos sanos sustenta intrínsecamente a una pequeña población de bacterias. El desarrollo de procesos infecciosos en la córnea implica necesariamente la participación de receptores de reconocimiento de patrones que permitan la adherencia y colonización por patógenos. Estos receptores pueden no sólo estar implicados en el anclaje de las bacterias, sino también en otros aspectos del proceso infeccioso tales como el tropismo tisular, el desencadenamiento de la respuesta inmunitaria del huésped o la invasión microbiana. Determinados estudios previos a nuestro trabajo habían demostrado la implicación de los GAGs en el desarrollo de ciertas queratitis bacterianas, como en el caso de Staphylococcus aureus, responsable del 10-25% de los casos y por lo tanto una causa principal de esta patología.
Los GAGs poseen estructuras complejas que definen sitios de unión para una multitud de ligandos específicos, y esta característica los faculta para ser usados por los patógenos para mediar la interacción específica con ciertos tipos celulares del hospedador. De este modo, las interacciones entre GAGs y proteínas patógenas son a menudo el factor decisivo en las etapas iniciales de la infección. El propósito de nuestra investigación consistió en analizar el papel que desempeñan los GAGs en la adhesión de diversas bacterias patógenas a las células epiteliales de la córnea. El estudio incluyó tanto patógenos Gram positivos como Gram negativos y abordó analizar los aspectos moleculares de la interacción.
Para determinar el uso de GAGs de superficie corneal como receptores de anclaje, se eliminaron de la superficie celular mediante inhibición de su biosíntesis o degradación enzimática; en ambos casos, los tratamientos afectaron a la adhesión bacteriana de todos los patógenos implicados, indicando el uso universal de estas moléculas como receptores (Figura 7). Además, los efectos mostraron diferencias significativas entre patógenos Gram positivos y Gram negativos en todos los casos, indicando un uso diferencial de los GAGs (Figura 7). Para identificar las especies moleculares individuales responsables de la unión se llevaron a cabo experimentos de competencia, interfiriendo la adherencia con GAGs solubles, lo que mostró que el HS es la especie molecular esencialmente implicada (Figura 7). Experimentos análogos mostraron que la unión implica los dominios sulfatados presentes en la molécula y es muy dependiente de la longitud de la cadena sacarídica.
Figura 7.Las bacterias se adhieren a la superficie de las células epiteliales corneales utilizando los GAGs, fundamentalmente las cadenas de HS, como receptores. A: Diferencias en la adherencia a las células corneales tratadas con rodamina B o genisteína entre bacterias Gram-positivas (l) y Gram-negativas (¡). B: Diferencias de adherencia de bacterias Gram-positivas (l) y Gram-negativas (¡) a células corneales tratadas con heparinasas I y III, condroitinasa ABC o heparinasas + condroitinasa. C: Efecto inhibitorio de las distintas especies de GAGs solubles sobre la adherencia de los patógenos a las células. Las diferencias estadísticamente significativas se indican con ***, ** y *, que indican p<0.001, p<0.01, y p<0.05 respectivamente.
Las cadenas de HS parecen en la superficie celular unidas fundamentalmente a PGs del grupo de los sindecanos y glipicanos. La determinación de la expresión de estas proteínas en las células epiteliales corneales mostró transcripciones de distintos niveles de las 4 especies de sindecanos, pero sólo de algunos glipicanos, siendo GPC1 el más abundante (Figura 8). La eliminación de los glipicanos mediante PI-PLC, un enzima que hidroliza el anclaje a través del glicosilfosfatidil inositol no tuvo un efecto relevante sobre la adherencia bacteriana. El bloqueo individual de cada una de las especies de sindecanos con anticuerpos específicos tampoco resultó en efectos drásticos, pero sí cuando el tratamiento se hizo simultáneamente con anticuerpos frente a las 4 isoformas, mostrando que son las responsables de la unión de patógenos y que actúan de forma cooperativa (Figura 8).
Figura 8. Participación de los HSPGs de superficie celular en la unión de patógenos a células epiteliales corneales. A: Transcripción diferencial de HSPG de superficie celular en células corneales. B: Diferencias relativas de adherencia de bacterias Gram-positivas (l) y Gram-negativas (¡) después del tratamiento con anticuerpos anti-SDC o con PI-PLC. Las diferencias estadísticamente significativas se indican con ***, lo que indica p <0,001.
Para establecer la influencia de la sulfatación en las posiciones específicas de la unidad de disacáridos de las cadenas HS sobre la adherencia, se utilizó la interferencia de ARN para silenciar la expresión de los genes implicados en estas reacciones. El análisis de la adhesión de los patógenos a los clones knockout mostró que la disminución de la sulfatación redujo la unión de todos los microorganismos ensayados, viéndose particularmente afectada por la N- o 6-O-sulfatación, que implican el residuo de glucosamina, y en menor medida la sulfatación 2-O, que implica el residuo de ácido urónico, aunque este último presentó un patrón dependiente del tipo Gram de la bacteria (Figura 9)
Figura 9. Diferencias relativas de adherencia de bacterias Gram-positivas (l) y Gram-negativas (¡) a clones en los que se silenció la N-sulfatación, la 2-O-sulfatación y la 6-O-sulfatación. Las diferencias estadísticamente significativas se indican con **, lo que indica p <0,01. Utilizamos la interferencia de ARN para silenciar la expresión de los genes implicados en estas reacciones.
Figura 9. Diferencias relativas de adherencia de bacterias Gram-positivas (l) y Gram-negativas (¡) a clones en los que se silenció la N-sulfatación, la 2-O-sulfatación y la 6-O-sulfatación. Las diferencias estadísticamente significativas se indican con **, lo que indica p <0,01. Utilizamos la interferencia de ARN para silenciar la expresión de los genes implicados en estas reacciones.
En última instancia, la comprensión de la complejidad del proceso de adhesión abre la posibilidad de ejercer un control sobre las infecciones bacterianas mediante la prevención de la adhesión o etapas de invasión de la patogénesis bacteriana. Dado el grave problema que en la sanidad actual representa la expansión de las resistencias a antibióticos, nuestros estudios permiten plantear el empleo de moléculas inocuas, no inmunogénicas y no generadoras de resistencias.
Los resultados obtenidos fueron publicados en Frontiers in Cell and Infection Microbiology 2016 Nov 30;6:173. eCollection 2016. Una revisión del conocimiento actual acerca de la implicación de GAGs en procesos infecciosos bacterianos fue publicada en Frontiers in Microbiology 016 Feb 24;7:220. doi: 10.3389/fmicb.2016.00220. eCollection 2016.
Estudio de la adhesión de hongos patógenos sobre el tejido corneal
Las patologías infecciosas son procesos dependientes tanto de la virulencia del microorganismo como de la susceptibilidad del hospedador. Los microorganismos comparten en muchos casos estrategias comunes para causar la infección, particularmente en las fases iniciales de la misma que implican adherencia, colonización e invasión del tejido.
La adherencia es una etapa crucial en la interacción entre el hospedador y el patógeno y, entre las diferentes moléculas presentes en la superficie de las células, los proteoglicanos (PGs) y sus cadenas de glicosaminoglicanos (GAGs), son con frecuencia los responsables de este proceso. Estas moléculas constituyen receptores idóneos debido a su presencia en todos los tipos celulares. Por lo que su papel ha sido descrito en distintos epitelios, y en relación con distintos tipos de agentes infecciosos, particularmente bacterias y virus.
En el caso de las infecciones oculares, el ojo está protegido por diferentes elementos que pueden ser superados por traumas, alteraciones lacrimales o uso de lentes de contacto. La infección ocular supone, por una parte, una afectación a nivel local con posible pérdida de visión, y por otra, ser la posible entrada a una infección sistémica. Dentro de las infecciones más frecuentes se encuentran conjuntivitis, queratitis o endoftalmitis, susceptibles de tener un origen bacteriano, vírico o amebiano, pero también por hongos principalmente por los géneros Cándida (levadura), Fusarium (hongo filamentoso) y ocasiones Scedosporium (hongo filamentoso).
Dada la importancia y extensión que, en patologías oculares de elevada prevalencia como conjuntivitis, queratitis o endoftalmitis, desempeñan diferentes hongos patógenos, esta línea de investigación se basa en el estudio de los mismos sobre diferentes líneas celulares oculares, siguiendo un estudio análogo al desarrollado con bacterias por nuestro equipo de investigación.
Thomas, P. A., & Kaliamurthy, J. (2013). Mycotic keratitis: epidemiology, diagnosis and management. Clinical Microbiology and Infection, 19(3), 210-220.
Jinno, A., & Park, P. W. (2015). Role of glycosaminoglycans in infectious disease. Glycosaminoglycans: Chemistry and Biology, 567-585.