Queratocono
Alteraciones En La Expresión De Proteoglicanos En El Estroma Corneal De Pacientes Con Queratocono
La córnea es el principal elemento refractivo del ojo adulto. Consiste en tres capas, incluyendo una capa media gruesa conocida como estroma, separada por membranas basales de un epitelio estratificado externo y una capa interna de células endoteliales. El queratocono es una ectasia corneal que da lugar a que la córnea tome una forma cónica, impidiendo que la luz que entra en el ojo se enfoque correctamente en la retina y provocando distorsión de la visión. Causa astigmatismo severo, cicatrización y, en última instancia, pérdida de la visión en uno de cada cinco pacientes, que requieren trasplante de córnea. El queratocono es esencialmente una condición bilateral, aunque la presentación puede ser asimétrica. La incidencia del queratocono se estima entre 29 y 229 por 100.000, sin predominio de género, y está documentado que estas tasas varían entre los diferentes grupos étnicos.
Histológicamente, el queratocono exhibe muchas características anormales que afectan a diferentes capas de la córnea. El queratocono es un trastorno multifactorial con patrones de herencia complejos en el que factores ambientales como el uso de lentes de contacto, el frotamiento ocular crónico o la atopia del ojo parecen desempeñen un papel igualmente importante. El queratocono se presenta frecuentemente en aislamiento, pero a menudo se asocia con una amplia gama de trastornos oculares, incluyendo catarata, atopia, queratoconjuntivitis vernal, retinitis pigmentaria, amaurosis congénita de Leber, frotamiento ocular y uso de lentes de contacto duras. Esta patología también se produce con una serie de anomalías cromosómicas y trastornos del tejido conectivo como el síndrome de Ehlers Danlos, osteogénesis imperfecta, prolapso de la válvula mitral y craneosinostosis.
El estroma central constituye el 90% del espesor de la córnea, y consta de una matriz extracelular intercalada con queratocitos que ocupan aproximadamente el 10% de la sustancia propia. El estroma corneal se compone principalmente de fibrillas de colágeno, cada una de las cuales consiste en un núcleo de colágeno tipo V recubierto por colágeno tipo I, recubierto a su vez por diferentes PGs. Hay 5 PGs principales localizados en la matriz corneal: decorina (DCN), lumicano (LUM), keratocano (KERA), osteoglicina (OGN) y biglicano (BGN). Todas estas moléculas están incluidas en el grupo de pequeños proteoglicanos ricos en leucina (SLRPGs), aunque la decorina y el biglicano llevan cadenas de CS, mientras que los otros son las llevan de KS. Además, los queratinocitos expresan proteoglicanos de heparán sulfato (HSPGs), que están ubicuamente presentes en los tejidos y asociados principalmente con la superficie celular y la ECM. El modelo molecular actual del estroma corneal sugiere que los PGs desempeñan un papel fundamental en el establecimiento y mantenimiento de la disposición de fibrillas de colágeno regularmente espaciadas y uniformemente delgadas, lo que permite que la luz pase a través de la córnea.
Con anterioridad a nuestro trabajo, existían pocos estudios que examinasen las alteraciones en los PGs y GAGs corneales en relación con el queratocono, con el agravante de que las muestras analizadas en algunos de estos estudios incluyeron otras enfermedades y no sólo queratocono. Nuestros estudios abordaron la cuantificación de los niveles de transcripción de los genes
que codifican todas las proteínas núcleo de PGs presentes en la córnea, sí como todos los codificantes de los enzimas implicados en la síntesis de las distintas cadenas de GAGs asociadas (Figura 3). Los productos de expresión de aquellos genes que mostraron cambios en sus niveles de transcripción, incluyendo las cadenas de GAG, se analizaron mediante inmunohistoquímica en cultivos y en cortes corneales.
Figura 3. Genes implicados en la biosíntesis de las cadenas de GAGs. A: Genes de iniciación y elongación de las cadenas de HS y CS. B: Genes implicados en la elongación y modificación del disacárido de KS. C: Genes implicados en la modificación del disacárido de CS. D: Genes implicados en la modificación del disacárido de HS. Los diferentes genes para las enzimas que catalizan las reacciones específicas se destacan en rojo.
Las células estromales corneales de pacientes con queratocono mostraron subexpresión en los niveles de transcripción de los PGs portadores de cadenas de KS presentes en el estroma corneal (KERA, LUM, OGN). En lo referente a los enzimas responsables de la síntesis de las cadenas de KS, se pudo determinar una regulación negativa en la transferasa responsable de la adición de la N-acetilglucosamina (B3GNT7, figura 3), y un incremento el enzima responsable de la sulfatación del residuo de galactosa (CHST1, figura 3). Las determinaciones de los PGs mediante inmunohistoquímica confirmaron los resultados a nivel de proteína, tanto utilizando los cultivos de células corneales como secciones corneales (Figura 4)
Figura 4.Inmunohistoquímica de los KSPGs. Las dos columnas de la izquierda muestran los resultados obtenidos sobre cultivos de células estromales corneales (barra de escala: 50 µm), mientras que las dos columnas de la derecha muestran los resultados usando secciones corneales (Barra de escala: 100 µm). A, B, H, I: Keratocano. C, D, J, L: Lumicano. F, G, M, N: Osteoglicina. Las flechas muestran el epitelio. Las puntas de flecha muestran una mayor tinción
Dos PGs portadores de cadenas de CS son importantes en el estroma corneal: decorina (DCN) y biglicano (BGN), produciéndose una disminución de la transcripción de este último en células estromales corneales de queratocono. En lo referente a las cadenas de CS, se sobreexpresaron dos de los enzimas responsables de la polimerización (CSGALNACT1 y CHPF, figura 3) y varios de sulfatación (CHST12, CHST13, CHST15, CHST3, CHST7, figura 3), resultando en un incremento de cadenas de GAG sulfatadas. Ambos datos pudieron refrendarse a nivel de inmunohistoquímica, tanto en cultivos celulares como en secciones corneales (Figura 5)
Figura 4.Inmunohistoquímica de los CSPGs y de las cadenas sacarídicas de CS. Las dos columnas de la izquierda muestran los resultados obtenidos sobre cultivos de células estromales (barra de escala: 50 µm), mientras que las dos columnas de la derecha muestran los resultados usando secciones corneales (Barra de escala: 100 µm). A, B, E, F: Biglicano. C, D, G, H: CS. Las flechas muestran el epitelio. Las puntas de flecha muestran una mayor tinción.
Los PGs que acarrean cadenas de HS aparecen dispuestos tanto en la superficie de las células como pericelularmente. En la superficie celular se situan principalmente 4 isoformas de sindecanos (SDC1-4) y 6 de glipicanos (GPC1-6), observándose descenso en la transcripción de SDC1 y -2, así como de GPC4 y -6 en células de queratocono. Otras moléculas de HSPGs presentes en las células, incluyendo betaglicano (TGFBR3), CD44v3, neuropilina-1 (NRP1) y serglicina (SRGN) no mostraron alteraciones. En la zona pericelular aparecen 3 especies moleculares: perlecano (PRCAN), agrina (AGRN) y colágeno XVIII (COLXVIIIA1), apareciendo únicamente este último sobreexpresado en células patológicas. Todas estas alteraciones pudieron observarse mediante inmunohistoquímica (figura 5).
Figura 5. Inmunohistoquímica de los HSPGs. Las dos columnas de la izquierda muestran los resultados obtenidos sobre cultivos de células estromales corneales (barra de escala: 50 µm), mientras que las dos columnas de la derecha muestran los resultados usando secciones corneales (Barra de escala: 100 µm). A, B, K, L: Sindecano-1. C, D, M, N: Sindecano-2. E, F, O, P: Gipicano-4. G, H, Q, R: glipicano-6. I, J, S, T: Colágeno XVIII. Las flechas muestran el epitelio. Las puntas de flecha muestran una mayor tinción.
En lo referente a las cadenas de HS, pudieron determinarse mayoritariamente sobreexpresiones, afectando tanto a genes de polimerización (EXT2, figura 3) como de síntesis de la estructura fina de la molécula (NDST2, NDST3, NDST4, GLCE, HS2ST1, HS3ST2, HS3ST6, figura 3), aunque también algunas subexpresiones concretas (HS3ST1, SULF2, figura 3), lo que indica cambios importantes en la estructura del HS. Estos cambios pudieron observarse mediante inmunohistoquímica utilizando anticuerpos capaces de detectar epitopos con distinto grado de sulfatación (Figura 6)
Figura 6.
Inmunohistoquímica de las cadenas de HS. Las dos columnas de la izquierda muestran los resultados obtenidos sobre cultivos de células estromales corneales (barra de escala: 50 µm), mientras que las dos columnas de la derecha muestran los resultados usando secciones corneales (Barra de escala: 100 µm). A, B, G, H: epitopo 3G10 (generado mediante digestión con heparinasas). C, D, I, J: epitopo JM403 (incluye residuos no sustituidos de glucosamina). E, F, K, L: epitopo 10E4 (Incluye residuos sulfatados de glucosamina). Las flechas muestran el epitelio. Las puntas de flecha muestran una mayor tinción.
Nuestro trabajo ha permitido, por primera vez, una descripción exhaustiva de las alteraciones de los PGs en el estroma de pacientes con queratocono. Estos datos muestran que la estructura de la matriz está alterada, pero también a nivel de superficie celular, afectando a la interacción con ligandos y la respuesta a los mismos durante el desarrollo de la patología. Los resultados obtenidos han sido publicados en Investigative Ophthalmology and Visual Sciences (IOVS) 2016 May 1;57(6):2618-28. doi: 10.1167/iovs.15-16692.