Estudios en superficie ocular
Investigación En Regeneración E Inervación De La Superficie Ocular.
La línea de Investigación en Regeneración e Inervación de la Superficie Ocular está dedicada a la investigación básica de algunos de los problemas no resueltos de la neurociencia ocular. La integridad y la transparencia de la córnea dependen en gran medida del correcto funcionamiento del sistema nervioso de la córnea. Las lesiones en las aferencias nerviosas de la córnea producen alteraciones funcionales en la superficie ocular y afectan directamente a la transparencia y a la integridad de los tejidos de la córnea, incluyendo la formación de ulceras y perforaciones. Los nervios intervienen en los procesos de inflamación en la córnea y son el fundamento del dolor neuropático, lo
que les señala como ejes directores de la salud de la superficie ocular. Pese a su importancia, los procesos celulares y moleculares responsables de su funcionamiento todavía son poco conocidos.
El componente nervioso de la córnea es de una extremada complejidad y de una exquisita sensibilidad. La cornea tiene alrededor de 200 veces más terminaciones sensitivas que la yema del dedo o 50 veces más que la pulpa dental. Esta profusa red de receptores nerviosos es un excelente sistema de alarma del ojo frente a las agresiones externas y los cambios en el microambiente de la superficie ocular pero además, juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis del epitelio mediante mecanismos basales y reflejos regulados a nivel neural.
La línea de investigación del grupo se centra en el estudio de las distrofias y las lesiones nerviosas que afectan a la homeostasis de la superficie ocular y de los procesos de regeneración. Estudiamos los mecanismos moleculares y celulares involucrados en la degeneración de las fibras nerviosas de la córnea asociados por ejemplo con el envejecimiento y que originan patologías oculares como el ojo seco. Esta enfermedad cada vez más prevalente, causa alteraciones de la visión, inflamación, dolor y disconfort y disminuye significativamente la calidad de vida del paciente. Investigamos también los procesos necesarios para la correcta regeneración nerviosa en modelos de lesión nerviosa masiva de la región central de la córnea y diseñamos estrategias regenerativas y neuroprotectoras.
Asimismo, trabajamos para descubrir los mecanismos moleculares que subyacen a la degeneración de los axones de las neuronas periféricas que inervan la córnea relacionados con enfermedades neurodegenerativas, ya que pueden ser indicadores tempranos de la enfermedad neurológica.
El objetivo general es el estudio de los procesos degenerativos que afectan a la inervación sensorial de la córnea, de su importancia en la enfermedad de la superficie ocular y de los mecanismos de regeneración y neuroprotección.
Podemos dividir los factores desencadenantes de la degeneración axonal en la córnea según su origen: endógenos y exógenos. Atendiendo al estudio y la solución de la degeneración axonal en la córnea, nuestros proyectos de investigación durante 2016 fueron:
Proyecto I: Envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas. Ojo Seco.
a) Envejecimiento:
El proceso de envejecimiento natural afecta a todos los tejidos de manera progresiva. El sistema nervioso no es una excepción. Las personas mayores pierden visión, oído, percepción olfativa e incluso gusto. Pero también ven disminuida su sensibilidad general. Tacto fino, temperatura y dolor son sensaciones que se ven alteradas con la edad. En muchas ocasiones un estímulo normalmente inocuo se convierte en una sensación dolorosa y molesta, lo que denominamos alodinia. Normalmente se considera que a medida que envejecemos, perdemos un numero
importante de receptores sensitivos y que esta es la causa de la disfunción sensorial.
Algunas patologías como la diabetes pueden acelerar la degeneración de los nervios y agravar el proceso, llegando incluso a producir ulceras crónicas y dolorosas en la piel.
Sin embargo, no todas las estructuras parecen ser igualmente vulnerables al envejecimiento. En nuestro laboratorio hemos estudiado la inervación sensorial de la superficie ocular en ratones envejecidos y nos hemos centrado en el análisis de los receptores sensitivos de frio por su especial importancia en la regulación de la producción de lagrima.
Hemos identificado y caracterizado funcional y molecularmente dos poblaciones de neuronas receptoras de frio que presentan el canal iónico TRPM8 en la córnea. Además, estos dos tipos de neuronas tienen funciones diferentes. El primer tipo tiene un papel regulador de la producción de lagrima y creemos que contribuye al bloqueo del
dolor inhibiendo otras neuronas polimodales. El segundo tipo tiene características típicas de un nociceptor clásico. Atendiendo únicamente a estos dos tipos de fibras nerviosas de la córnea, observamos que el envejecimiento afecta de manera diferente a cada uno de ellos, con interesantes procesos degenerativos singulares en las aferencias
corneales: la degeneración asociada a la edad de las fibras de frio se da casi exclusivamente en el primero de los dos tipos de fibras, mientras que el otro no está afectado significativamente. La desaparición selectiva del tipo “regulador” de fibras TRPM8 se asocia con la disfunción de la producción de lagrima. El tipo “nociceptor” de fibras TRPM8 que permanecen presentes en los animales más viejos expresan marcadores de dolor e inflamación. Según nuestra hipótesis, estas últimas serían las responsables de la aparición de las sensaciones molestas y dolorosas que acompañan a la disfunción lagrimal en los pacientes de avanzada edad. Así, en los animales envejecidos encontramos una actividad eléctrica en una población de terminales de frio que se parece a la de las fibras reguladoras (que en condiciones normales tienen una actividad basal constante) pero con una intensidad de respuesta superior y más prolongada, similar a la de las fibras polimodales.
Figura 1. Evolución temporal de los terminales responsables de la sensación de frio en la córnea. Entre los 3 y los 9 meses de edad ya se aprecia una disminucion significativa del numero de terminaciones.
Figura 2. Porcentaje de fibras de frio encontradas en ratones de 3 y 24 meses de edad.
De esta manera hemos podido relacionar directamente la perdida selectiva de fibras nerviosas en la cornea con la disfuncion lagrimal asociada a la edad en un modelo que refleja fielmente los signos patologicos del ojo seco: disfunción lagrimal, inflamación y dolor.
Ademas, es posible que la implicacion del canal TRPM8 en la funcion de la superficie ocular no este restringida a la regulacion de la produccion de lagrima. En animales KO envejecidos para la proteina TRPM8 hemos observado una alta frecuencia de ulceras corneales espontaneas, sin ningun otro desencadenante que la falta de la proteína TRPM8 funcional. Los patrones de expresion de los receptores de neurotrofinas en el epitelio de estos ratones difieren de los de sus analogos silvestres.
Se propone una función trófica específica para las fibras TRPM8 de tipo I, posiblemente mediada por factores de crecimiento distintos de NGF.
La actividad dual del canal TRPM8 lo define como diana terapéutica para la solución del dolor neuropático e inflamatorio.
Por otro lado, comprender cuál es la razón por la que un tipo de neuronas tan restringido presenta una mayor vulnerabilidad a la degeneración, abre vías para el diseño de terapias neuroprotector.
b) Enfermedades neurodegenerativas:
En estrecha relación con el envejecimiento se encuentran las enfermedades neurodegenerativas. En la actualidad se considera que las enfermedades neurodegenerativas son enfermedades sistémicas con sintomatología y afectación
predominante en el sistema nervioso central. Las evidencias clínicas que definen una enfermedad neurodegenerativa suelen ser déficits cognitivos o motores severos, detectados en edades avanzadas. Sin embargo, el inicio y el progreso de la enfermedad ocurre en etapas mucho más tempranas de la vida. Los procesos de plasticidad neural
y sináptica del cerebro ocultan la progresión de la patología y mantienen la funcionalidad cognitiva y motora hasta un punto de inflexión tardío. En algunas enfermedades neurológicas como el Parkinson, se pueden detectar altos
niveles de α-sinnucleina (un biomarcador de la enfermedad) en biopsias de colon hasta 15 años antes de la presentación de los primeros síntomas motores.
En la enfermedad de Alzheimer se pueden detectar también neuropatías periféricas en biopsias de piel de los enfermos. En modelos animales de enfermedades neurodegenerativas hemos observado que el ojo es extremadamente vulnerable a las enfermedades sistémicas, como por ejemplo en el caso de la encefalopatía hepática. Tanto la retina como la inervación de la córnea podrían mostrar signos precoces de degeneración nerviosa, previos a la aparición de las deficiencias cognitivas típicas de la enfermedad neurológica. En nuestro caso, hemos observado que ratones con patologías neurodegenerativas presentan ciertas neuropatías en la córnea. Los axones distróficos,
en este caso, muestran similitudes tanto con procesos “Dying back” como con degeneraciones anterógradas similares a degeneración Walleriana. Esta mezcla de mecanismos podría indicar una afectación neuronal directa, que a su vez está sustentada por la presencia de la proteína TAU hiperfosforilada en el soma y el axón. Además, se
observa la modificación de otros tejidos como el epitelio, ya sea de manera primaria o secundaria al inicio de la patología. En el epitelio de ratones transgénicos dobles APP/PS1 (un modelo animal de enfermedad de Alzheimer) hemos observado por primera vez incrementos de expresión del precursor de β-amiloide. Lo interesante de estos hallazgos es que los hemos observado en etapas muy anteriores al inicio de los síntomas neurológicos y podrían tener importancia a la hora de diseñar un marcador precoz de la enfermedad.
Figura 3: La imagen A muestra la expresión de Beta Amiloide en el epitelio de un ratón APP/PS1, modelo experimental de la enfermedad de Alzheimer. Los ratones sanos no expresan la proteína. En la imagen B se observan numerosos axones en la parte inferior del epitelio corneal de un ratón APP/PS1 con numerosas distrofias y alteraciones estructurales.
Figura 4: Vista de las fibras nerviosas distróficas de la cornea de un raton APP/PS1. Notese la elevada cantidad de varicosidades
Proyecto II: Modelo experimental de lesión inducida y regeneración neural
a) Estudio de la regeneración nerviosa en lesiones quirúrgicas experimentales.
Utilizando un modelo propio de lesión de la córnea por ablación laser (cirugía foto-refractiva o PRK) podemos producir una lesión por anotomía de todo el plexo nervioso subbasal de la córnea. A lo largo de un periodo de 3 meses se estudian los parámetros morfológicos de regeneración, su relación con la cicatrización del tejido y la recuperación de la función anterior a la lesión. Estos resultados serán muy valiosos para diseñar terapias dirigidas a la reparación corneal y al alivio del dolor postquirúrgico. La implicación en la regeneración nerviosa de otros tipos celulares no nerviosos tales como la glía, los fibroblastos y las células inflamatorias, es muy poco conocida tanto en
la literatura como en la práctica clínica. Nuestro objeto de estudio son los canales TRPs y su papel en el ensamblaje y desensamblaje de los neurotúbulos durante la regeneración y la relación de los axones con su medio ambiente (glía y matriz extracelular). Nuestra aproximación técnica consigue identificar los factores celulares implicados en la reparación tisular y situarlos temporalmente. Es importante también conocer el cambio en el ambiente extracelular durante la regeneración y su implicación en los casos de regeneración aberrante. El establecimiento de los parámetros basales de la regeneración nos sirve de origen para la experimentación de diferentes estrategias regenerativas. Actualmente se han probado varios tratamientos experimentales sobre esta plataforma. Como ejemplo, se han probado compuestos con propiedades antioxidantes como el azafrán, componentes de la matriz extracelular como los glicosaminoglicanos de heparan sulfato o de condroitín sulfato, nanocápsulas poliméricas, PRGF, ARN de interferencia…
Utilizando como agentes regenerativos diversos componentes de la matriz extracelular, como el heparan sulfato (HS) y el condroitín sulfato (CS), pudimos comprobar que la aplicación de HS aceleraba la cicatrización del epitelio durante los primeros días después de la lesión, comparado con un control (solución salina, BSS). El CS presenta un menor poder regenerativo durante las primeras horas, como se aprecia en los gráficos inferiores. La calidad de la regeneración, medida en términos de transparencia de la córnea, también se vio incrementada tras la aplicación
de HS y CS.
Se cree que, durante la regeneración nerviosa de un nervio periférico, el HS funciona como un sustrato facilitador, quizá gracias a su capacidad para asociar factores de crecimiento, mientras que el CS no promueve la elongación de los axones. En nuestro experimento, se podría explicar la mayor velocidad de cicatrización con HS por la contribución trófica de los nervios en regeneración a la consolidación del epitelio. La adición de CS, por el contrario, no favorecería el crecimiento de los nervios y la cicatrización epitelial es más lenta.
Actualmente estamos comprobando estas observaciones preliminares con el estudio de la regeneración nerviosa en la córnea y su relación con los glicosaminoglicanos de la matriz extracelular.
Figura 1: Evolución de la cicatrización de la lesión en los animales tratados con BSS (control), coctel de CS y con HS.
Figura 1: Evolución de la cicatrización de la lesión en los animales tratados con BSS (control), coctel de CS y con HS.
Figura 2: Porcentaje de corneas totalmente epitelizadas según el tratamiento recibido y el grupo temporalcoctel de CS y con HS.
Figura 5: Inmunofluorescencia de los núcleos tenidos con DAPI de células ARPE-19 crecidas en membrana de
Figura 3: Comparativa de la evolución del grado de haze en función del tiempo y del tratamiento recibido.
Figura 4: Vista de la región periférica de la lesión corneal donde se observa la ramificación y prolongación de los axones en regeneración hacia el centro de la córnea (situado en la esquina inferior derecha de la imagen).
Figura 4: Vista de la región periférica de la lesión corneal donde se observa la ramificación y prolongación de los axones en regeneración hacia el centro de la córnea (situado en la esquina inferior derecha de la imagen).
La velocidad de regeneración en la córnea depende de la existencia de un sustrato adecuado para la emisión de neuritas y de la presencia de las dianas terminales de los receptores. En nuestros experimentos, generalmente no encontramos axones en regeneración con anterioridad a la completa reepitelización del area lesionada, que suele ocurrir entre los 3 y los 4 dias despues de la lesión. Los registros electrofisiologicos no consiguieron determinar actividad electrica en el centro de la cornea hasta los 15 dias post-lesión y esta actividad era anormal en intensidad y amplitud. Al cabo de 30 dias se observan numerosos axones en el plano del plexo subbasal con disposicion radial y aspecto lineal, semejante al de la cornea sana excepto por su baja densidad. En este estadio es posible registrar terminaciones nerviosas con actividad electrica normal. A los tres meses de recuperacion la inervacion de la superficie de la cornea tiene una apariencia normal, observandose incluso la formacion de un vortex apical nervioso.
La actividad electrofisiologica en esta etapa es normal.
Figura 5: Porcentaje de fibras nerviosas encontradas con actividad electrofisiológica en la córnea 15 días después de la lesión.
Actualmente estamos trabajando en identificar el fenotipo neuroquímico y funcional de cada uno de los tipos de receptores sensitivos de la superficie ocular resultantes de la regeneración. Estos datos aportaran información relevante en para el estudio de la calidad de la regeneración nerviosa y de las sensaciones dolorosas que suceden durante el proceso de reparación corneal. Es interesante conocer que la calidad de la regeneración nerviosa depende de la capacidad de la neurona para conseguir emitir y guiar apropiadamente un axón y que esto es función de una afinidad neurotrófica caracteristica. A modo de ejemplo, la poblacion de fibras sensitivas de la cornea que contiene TRPM8 a su vez se divide en subpoblaciones con distinta afinidad por factores de crecimiento nervioso. En este sentido, hemos observado que la presencia del canal TRPM8 contribuye de manera significativa a la regeneración nerviosa de la cornea. Los animales KO (no presentan una forma funcional de TRPM8) muestran un patron de regeneración corneal nerviosa alterado y deficiente.
b) Estudio de la lesión nerviosa inducida por radiación luminosa.
Aparte de las lesiones nerviosas traumáticas o quirúrgicas que afectan masivamente a la inervación sensorial de la cornea, otros muchos agentes externos pueden ser considerados factores de degeneración exógenos en la cornea. La radiación luminosa de una determinada longitud de onda, por ejemplo, ha sido descrita como inductora o potenciadora de degeneración y muerte celular en células de la retina, sobre todo si la retina sufre un estado patológico.
En nuestro laboratorio hemos comprobado que la cornea también se ve afectada por la radiación lumínica y que daña preferentemente elementos nerviosos. concretamente, hemos reconocido estructuras degenerativas en los axones coincidentes con mecanismos de degeneración “Dying back”. Durante 2016 hemos mejorado nuestra técnica de visualización y procesamiento y podemos determinar cuáles son los elementos nerviosos más vulnerables a la radiación luminosa. Nuestra hipótesis, compartida con el Dr. Neville Osborne, es que la luz interfiere en la actividad normal de la cadena respiratoria de la mitocondria, reduciendo su capacidad de respuesta frente al estrés oxidativo.
La acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS) produce el deterioro de la función mitocondrial, necesaria para la actividad normal de la neurona. En el ambiente local del axón, los micro túbulos se desestabilizan a consecuencia del déficit mitocondrial y la fosforilación de TAU, agrupándose en engrosamientos de la membrana (varicosidades) a lo largo del axón. El trafico vesicular a lo largo del axón se ve interrumpido y finalmente la membrana plasmática del axón se reabsorbe, originando esférulas degenerativas. La función de la fibra nerviosa se pierde. Este proceso de formación de esférulas degenerativas es muy frecuente en los axones TRPM8 de tipo I, relacionados con la percepción de temperaturas de 18 a 28 grados centígrados. De manera interesante, estos terminales son los únicos que tienen una estimulación constante en la cornea que –funcionan entre 18 y 28 grados- y por consiguiente presentan una actividad electrofisiológica basal elevada. Tal actividad requiere de un aporte energético alto.
Por ello, estas fibras se caracterizan por presentar una gran cantidad de mitocondrias en sus axones, agrupadas en engrosamientos de la membrana que llamamos “beads”.
Los beads se diferencian facilmente de las varicosidades distroficas por su regularidad y frecuencia.
Figura 4: Fibras nerviosas de la cornea danadas por irradiacion luminica. Se puede comprobar como la degeneracion afecta de manera preferente a los axones identificados en color verde, que se corresponden con los receptores de frio TRPM8. El resto de los axones, visualizados en rojo, no estan danados o en menor grado.
De esta manera, pensamos que la mayor vulnerabilidad de un determinado tipo de fibras podria estar explicada de manera molecular por la acumulacion de ROS. Es interesante tambien hacer notar que ROS es capaz de inducir la produccion de glutamato en las neuronas. El glutamato es un neurotransmisor relacionado con la via de dolor central y en exceso, puede causar la muerte de la neurona diana por excitotoxicidad.
Una vez comprendamos este escenario, el siguiente paso sera la aplicacion de terapias neuroprotectoras para inhibir o prevenir el dano inducido exogenamente. Una neuroproteccion eficaz produciria el rescate de las fibras que se ven afectadas por el envejecimiento, por ejemplo.