Neurobiología de la retina
Estudios de Neuroprotección
La línea de Neuroprotección centra su investigación en el estudio de las bases moleculares de enfermedades neurodegenerativas que afectan a la retina, además de buscar y analizar agentes con potencial neuroprotector con la finalidad de poder ofrecer tratamientos más eficaces para estas patologías.
Según los últimos datos recogidos por la Organización Mundial de la Salud en 2014, el glaucoma se presenta como la tercera causa de discapacidad visual y la primera causa de ceguera irreversible, ya que las más comunes, los errores de refracción y las cataratas, son consideradas problemas de fácil corrección mediante cirugía. En España, ya en 2008, se señalaba al glaucoma como el responsable del 31% de las discapacidades visuales del país.
La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es otra de las patologías neurodegenerativas con mayor afectación en personas mayores de 55 años. En España, se estima que tiene una prevalencia del 5,3 %, porcentaje que aumenta según se incrementa la edad (13% en mayores de 65 años y 30% entre los mayores de 75).
Según los expertos se prevé que estas cifras vayan en aumento debido a la mayor esperanza de vida de la población, por tanto, las enfermedades degenerativas de la retina forman parte de un problema no resuelto de grandes dimensiones que requiere de nuevos abordajes, ya que, hasta el momento no existen tratamientos de eficacia elevada.
El glaucoma es una neuropatía óptica asociada a la degeneración de los axones de las células ganglionares de la retina que conlleva una pérdida de campo visual irreversible. No presenta una sintomatología clara hasta que la enfermedad se encuentra en un estado avanzado y por tanto el diagnostico suele producirse cuando ya existe un
importante daño neuronal.
La DMAE provoca un deterioro progresivo del epitelio pigmentario de la retina y de las células fotorreceptoras produciendo una pérdida de la visión central. Existen dos formas de DMAE; seca o atrófica y húmeda o exudativa. La DMAE atrófica es la forma más frecuente de la patología, afectando a más del 80% de los pacientes y suele estar relacionada con el envejecimiento. Con la edad los desechos del elevado metabolismo que requiere la retina, se van acumulando entre la coroides y la retina formando depósitos denominados drusas. Esto provoca la separación de la retina de la fuente de la que se nutren los fotorreceptores y como consecuencia se produce la degeneración y muerte de las células.
Proyecto I. Exposición a la luz y enfermedades degenerativas de la retina.
El glaucoma y la DMAE son patologías que presentan una afectación de tipos celulares muy especializados con unos requerimientos energéticos muy elevados. Para suplir esa demanda, tanto las células ganglionares de la retina como los fotorreceptores presentan en su citoplasma una elevada concentración de mitocondrias. Las mitocondrias son los orgánulos de las células eucariotas cuya función principal es la regulación del metabolismo energético, aunque también juegan un importante papel en vías de señalización, diferenciación celular, proliferación y muerte celular.
A nivel celular, son diversos los autores que han mostrado una afectación mitocondrial en estas patologías. Son múltiples las causas implicadas en enfermedades neurodegenerativas como el glaucoma o la DMAE, aunque las más destacadas son el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial y la ex citotoxicidad.
El grupo de Neurobiología de la Retina estudia y analiza el papel que las mitocondrias desempeñan el mantenimiento de la integridad celular y su afectación en las enfermedades neurodegenerativas de estudio. Además, este equipo ha mostrado y continúa obteniendo información sobre como la exposición a luz, y más concretamente al componente del azul (de longitudes de onda corta) afecta de manera negativa a los diferentes tipos celulares de la retina. En este sentido, y continuando con el trabajo previa está desarrollando un modelo in vivo que produce un daño en la retina por una exposición intermitente y a baja intensidad de luz azul (Figura 1).
Figura 1: Cortes transversales de retina marcados para GFAP (verde) y DAPI (azul). El GFAP es un marcador asociado con los astrocitos y los pies de las células de Muller en la capa de las células ganglionares de la retina en condiciones fisiológicas, que aumenta su expresión tras un daño localizándose en las células de Muller a través de la retina. El DAPI es un colorante para marcar los núcleos de las células. La imagen de la izquierda muestra una retina sana (control) con expresión de GFAP asociada principalmente a la capa de las células ganglionares. A la derecha, se muestra una imagen transversal de retina donde se observa un incremento de la expresión de GFAP a través de la retina producida por la exposición a luz azul (daño foto toxico).
Proyecto II. Bases moléculas de la neuroprotección de la luz roja.
Estudios previos del grupo han mostrado el papel neuroprotector de la exposición a luz roja frente a diversos, incluido un daño isquémico con posterior reperfusión, uno de los procesos que suelen producirse en patologías como el glaucoma, donde se observó una reducción significativa en la perdida de células ganglionares de la retina provocada por el daño. En la actualidad, se está analizando si otros tipos celulares de la retina como las células del epitelio pigmentario de la retina (ERP), uno de los tipos celulares afectados en la DMAE. Los primeros resultados indican que la luz roja, no solo no produce efectos adversos en células de ERP en cultivo in vitro, sino que además
tiene la capacidad de reducir los efectos negativos de un daño cuando se realiza un tratamiento previo a la exposición del toxico.
CLa línea celular ARPE-19 es una línea celular de epitelio pigmentario de retina de células adherentes que forman monocapas estables, las cuales exhiben polaridad morfológica y funcional. El grupo de Neurobiología de la Retina de la Fundación de Investigación Oftalmológica cuenta con esta línea celular; y se han desarrollado varios estudios preliminares sobre el daño por luz de longitud de onda corta en el EPR empleando como modelo las ARPE-19. Hasta ahora se ha puesto a punto la línea celular, localizando la expresión de diferentes marcadores específicos de la misma mediante técnicas de inmunofluorescencia. Igualmente, se ha optimizado su cultivo en insertos (Figura 5), lo que permitirá comenzar con el trabajo de caracterización de la función de transporte mediante el estudio de la resistencia eléctrica transepitelial.
Figura 5: Inmunofluorescencia de los núcleos tenidos con DAPI de células ARPE-19 crecidas en membrana de Policarbonato. Fotografía de la membrana a campo claro y composición de ambas. En la parte inferior se observan las secciones transversales de
los mismos.
Figura 2: Células de ERP de la línea celular ARPE-19 en cultivo. A la izquierda células mantenidas en condiciones óptimas de crecimiento. En el centro, se observa una reducción de la densidad celular en aquellas que fueron expuestas a un daño fototoxico (luz azul). La fotografía de la derecha muestra como el tratamiento previo de luz roja antes de la exposición al fotodaño, protege a las células de la acción nociva.
Los estudios realizados indican el potencial beneficio del uso de la luz roja, sin embargo, los mecanismos subyacentes que se producen por la acción de la luz roja sobre las células permanece sin esclarecer. Los estudios previos realizados indican una acción a nivel mitocondrial junto con un efecto directo sobre los sistemas antioxidantes. De este modo, se continúan los estudios relacionados con las vías de señalización que se activan/inhiben por acción de este tipo de luz.
Proyecto III. Neuroprotección mediante material nanoluminiscente.
El proyecto RETINETA, de tres años de duración, ha sido parcialmente financiado a nivel estatal, enmarcado dentro del Programa Estatal de Investigación, Desarrollo e Innovación Orientada a los Retos de la Sociedad perteneciente al Plan Estatal de Investigación Científica y Técnica y de Innovación del Ministerio de Economía y Competitividad.
En este proyecto el Grupo de Neurobiología de la Retina de la Fundación de Investigación Oftalmológica, va de la mano del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega y de la Fundación asturiana ITMA. La finalidad del proyecto es el desarrollo de nuevos sistemas de neuroprotección para la retina, con el empleo de los últimos avances tecnológicos disponibles.
Proyecto IV. Lentes terapéuticas con conversores espectrales.
El proyecto EYECARELENS, de dos años de duración, es un proyecto en parte financiado a nivel estatal, enmarcado dentro del Programa Estatal de Investigación, Desarrollo e Innovación Orientada a los Retos de la Sociedad perteneciente al Plan Estatal de Investigación Científica y Técnica y de Innovación del Ministerio de Economía y Competitividad. Este proyecto tiene como objetico el desarrollo de un innovador sistema terapéutico para el tratamiento de diversas afectaciones oculares. En este proyecto el equipo de Neurobiología de la Retina va de la mano del Instituto Oftalmológico Fernández-Vega, la empresa Indo Optical S.L.U, además de la Fundación ITMA y la Universidad de Oviedo.
Proyecto V. Neuroprotección y Plasma Rico en Factores de Crecimiento.
El PRGF es un suero antólogo rico en factores de crecimiento obtenido a partir de la sangre del propio paciente. Diversos estudios han indicado que dicho suero tiene evidentes efectos beneficiosos sobre la regeneración ocular y la proliferación celular, entre otros efectos positivos. El estudio iniciado por el equipo de investigación pretende esclarecer si el PRGF puede actuar como agente neuroprotector en la retina, además de su posible uso en el campo de la regeneración a partir de determinadas estirpes neuronales.
Los primeros datos obtenidos en un modelo in vitro de daño en retina por luz azul ha mostrado la capacidad del PRGF para reducir la alteración de la expresión molecular y el daño celular en la retina. Como puede observarse en la figura 3, el PRGF reduce la expresión en retina de marcadores activados por el daño celular, como es el caso de la Hemoxigenasa-1 (HO-1), proteína de respuesta a estrés que puede ser inducida por agentes que causan estrés oxidativo.
Figura 3: Cortes transversales de retina marcados con HO-1 (verde) y DAPI (azul). En la izquierda retina expuesta a un daño fototóxico por luz azul y tratada con suero fisiológico (BSS), usado como control. Se observa que la luz azul produce un incremento generalizado de la expresión de HO-1 en la retina. Por el contrario, en la fotografía de la derecha, se muestra un corte de retina expuesta al daño fototóxico que ha recibido previamente el tratamiento con PRGF.
Proyecto VI. Epitelio pigmentario de la retina y la encima MTHFR.
La metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) es una enzima muy importante para la regeneración de metionina, tanto es así que su deficiencia, debida a mutaciones en el gen MTHFR que la codifica, altera su actividad y repercute tanto en el metabolismo de la homocisteína como en el metabolismo de los neurotransmisores y otras reacciones metabólicas. En la práctica clínica, se ha visto como un gran número de pacientes que compartían una serie de disfunciones retinianas especialmente relacionadas con el epitelio pigmentario de la retina (EPR), presentaban esta
mutación. Entre las disfunciones, destaca la acumulación de fluido subretiniano.
El EPR es una monocapa celular polarizada que posee una gran actividad metabólica imprescindible para el circuito visual. Cada célula del EPR se encuentra estrechamente unida a sus células contiguas, formando la barrera hematorretiniana externa, esencial para el desarrollo, la supervivencia y la actividad fisiológica de células visuales.
Este proyecto pretende caracterizar diversas funciones en una línea de epitelio pigmentario de retina (ARPE-19) (Figura 4) con el objetivo de evaluar el efecto que tiene en ellas la funcion alterada de la enzima MTHFR, así como la relación con la concentración del aminoácido metionina y de otros compuestos de la ruta metabólica afectados por la mutación. Para ello se desarrollarán técnicas de cultivo celular en las que se podrán llevar a cabo estudios in vivo y se analizara tanto su morfología como las variaciones de expresión proteica y de expresión génica de diferentes marcadores que podrán verse afectados.
Figura 4: En ambas imágenes se puede observar la expresión del marcador RPE65 en rojo y los núcleos tenidos en azul con DAPI. La imagen de la izquierda corresponde a un EPR de rata y la imagen de la derecha la línea celular ARPE-19 cultivada sobre membrana de policarbonato.
